1. 数据是计数数据，因为它是与基因对齐的计数数。它不是连续的，因此不能建模为正态分布。
2. 泊松分布是为计数数据建模而设计的。
3. 然而，泊松分布假设一阶矩和二阶矩（均值和方差）相等。这不适用于 RNA-Seq。低表达基因比高表达基因具有更高的变异性。
4. 为了解释可变性，我们使用负二项式模型，它实际上是泊松的扩展。NB 模型有一个额外的参数来为方差建模。可以证明，作为均值的方差方法，NB 模型变成了 Poisson 模型。

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要回答您的意见：

1. 标准化通常是对文库之间不同的测序深度建模所必需的。但是，如果您使用 DESeq2 或 edgeR，则不需要自己做。他们有自己的归一化算法（修剪均值和上四分位数）。

2. 这些包为您进行规范化。将您的数据拟合到 NB 模型，估计离散度（即：方差）。一旦他们有了模型，他们就可以使用所需的任何统计方法（我认为这是 DESeq2 的 Wald 检验）来检查差异表达的基因。结果取决于它们表达了多少以及它们有多少差异。

通常对计数进行建模时考虑到：

1 - 它们只取整数值
2 - 它们总是非负数
3 - （最重要的是）它们的可变性随着它们的平均值而增加

当计数的离散度大于 Poisson 的预期值时，使用负二项式。在这两种情况下，通常使用对数链接进行建模。